Técnica de PCR duplex usando el gen E y RNasa P para el diagnóstico de SARS-CoV-2

Tema: Técnica de PCR duplex usando el gen E y RNasa P para el diagnóstico de SARS-CoV-2

Objetivo: Comparar el límite de detección, sensibilidad y especificidad de la técnica de PCR duplex en muestras de ARN de un aislado de SARS-CoV-2

Tipo de muestras biológicas: ARN de pacientes aislados con SARS-CoV-2

Tipo de ácido nucleico: ARN genómico

Gen o secuencia a analizar: gen E y RNasa P

Tipo de PCR: PCR duplex

Extracción: Se realizó la extracción a partir de sobrenadantes de cultivo usando el sistema automatizado de extracción SaMag-12 y el estuche comercial SaMag™ Viral Nucleic Acid Extraction Kit, con un volumen de elución de 30 μL. La extracción de ARN como tal se realizó a partir de muestras de aspirado nasofaríngeo o hisopado nasofaríngeo de pacientes con sospecha SARS-CoV-2, utilizando dos sistemas automatizados con tecnología de magnetos para la extracción de ARN Magmax y SaMag en LIME e IMV, respectivamente; además, se realizaron extracciones manuales con el Quick-RNA Viral Kit. El volumen de elución para los kits automatizados fue de 30-50 μL y para el kitmanual de 15 μL. Es importante destacar que se realizó extracción a través de diferentes metodologías, con la finalidad de ampliar la capacidad diagnóstica del laboratorio y de acuerdo con la disponibilidad de reactivos en el momeno del estudio.

Pasos: Se utilizaron los cebadores y sondas para los genes. El gen RNasa P fue empleado como control interno de reacción y se amplificó usando dos pares de oligonucleótidos cebadores diseñados en la unión exones 1 y 2 del gen RNasa P (RNasa-P-Fw: 3'-ATGGCGGTGTTTGCAGATTTG-5' y RNasa-P-Rv: 3'-CAACTGAATAGCCAAGGTGAGC-5' ) para asegurar la amplificación del ARN extraído, excluyendo el ADN genómico.

Visualización:

En la imagen observamos el efecto de altas concentraciones de ARN humano en la amplificación del gen E por técnica de PCR dúplex (gen E/ más RNasa P). Se observan dos curvas de amplificación correspondientes al marcador E en PCR dúplex para las diferentes diluciones del ARN viral proveniente del cultivo.

Referencia bibliográfica:

1. Palacio Rua K, García Correa JF, Aguilar-Jiménez W, Afanador Ayala C, Rugeles MT, Zuluaga AF. Validación de una técnica de PCR dúplex usando el gen E y Nasa P para el diagnóstico de SARS-CoV-2. Enferm infecc microbiol clin (Ingl ) [Internet]. 2021;40(8):428–35. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0213005X21000197